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CKX53倒置顯微鏡熒光升級及活死細胞雙色熒光染色（Calcein AM/PI法）方案

更新時間：2026-07-28

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OLYMPUS CKX53倒置顯微鏡熒光升級及
活/死細胞雙色熒光染色（Calcein AM / PI法）檢測應用解決方案

基于 CKX-UVBG-E 電動智能熒光模塊的高效細胞活性評估指南

CKX53倒置顯微鏡熒光升級及活死細胞雙色熒光染色（Calcein AM/PI法）方案

一、方案背景與 Calcein AM / PI 雙色熒光檢測原理

在細胞生物學、組織工程、藥物篩選及腫瘤學研究中，精確評估細胞活力與死存狀態是基礎且關鍵的實驗環節。Calcein AM（乙氧基甲基熒光素阿醋酸酯）與 Propidium Iodide（碘化丙啶，PI）聯合使用的雙色熒光染色法，能夠同步對同一視野下的活細胞與死細胞進行特異性標記，具有高靈敏度與直觀性強的特點。

1.1 雙色熒光探針的作用機制

熒光探針	膜穿透特性	胞內分子靶點與反應機制	激發/發射光譜及 CKX-UVBG-E 適配通道
Calcein AM (活細胞標記)	細胞膜透過型 (脂溶性)	無熒光的 Calcein AM 穿透活細胞膜，被胞內內源性活性酯酶水解為帶強負電荷的 Calcein，滯留于胞質內發出強綠色熒光	Ex: 470/35 nm / Em: 525/45 nm (匹配 B 激發組 / FITC)
Propidium Iodide (PI) (死細胞標記)	非膜透過型 (僅透過受損膜)	無法穿透完整活細胞膜；僅當細胞死亡或質膜破損時穿入胞內，與雙鏈 DNA 嵌合發出紅色熒光	Ex: 545/25 nm / Em: 605/65 nm (匹配 G 激發組 / TRITC)

二、 CKX53 倒置顯微鏡熒光升級方案（CKX-UVBG-E 模塊）

常規奧林巴斯 CKX53 顯微鏡主要用于明場及相襯活細胞觀察。通過加裝專為 CKX53 量身開發的 CKX-UVBG-E 電動智能熒光模塊，無需更換顯微鏡主體即可快速升級為高性能倒置熒光顯微平臺：

2.1 高度集成一體化與內陷槽緊湊安裝設計

CKX-UVBG-E 模塊將大功率 LED 光源與熒光激發塊高度集成于單一盒體內，采用了內陷安裝槽與殼體卡扣設計，結構緊湊且外部固定螺絲少。升級后熒光模塊極薄，不遮擋載物臺下方空間，確保物鏡轉換順暢無阻。

CKX53倒置顯微鏡熒光升級及活死細胞雙色熒光染色（Calcein AM/PI法）方案

2.2 電動智能通道切換與 1.44 英寸彩色大屏

模塊配備 1.44 英寸彩色顯示屏，以彩色方柱和百分比數值清晰顯示當前通道狀態及激發光亮度。實體按鍵與編碼標記讓通道切換一目了然；配合防滑指壓旋鈕，單指即可快速旋轉與點擊操控，極大提升了實驗效率。

CKX53倒置顯微鏡熒光升級及活死細胞雙色熒光染色（Calcein AM/PI法）方案

2.3 長壽命 LED 光源與通道光強智能記憶

采用大功率 LED 光源（使用壽命 > 30000 小時），即開即用，無需傳統高壓汞燈繁瑣的預熱與冷卻等待。系統支持多達 4 色獨立熒光通道，內置通道光強記憶功能——當在 B 通道（檢測 Calcein 綠光）與 G 通道（檢測 PI 紅光）之間切換時，模塊能自動還原之前設定的光照強度，避免重復微調導致樣本熒光淬滅。

CKX53倒置顯微鏡熒光升級及活死細胞雙色熒光染色（Calcein AM/PI法）方案

2.4 低風噪主動循環散熱與軟件聯動擴展

模塊內置低風噪、低震動風扇進行主動循環風散熱，有效保障 LED 燈珠與濾光片的溫度穩定，防止光譜中心波峰漂移。同時，模塊支持外部協議通訊與軟件聯動控制，可無縫對接電腦端的圖像采集與分析軟件。

【CKX-UVBG-E 模塊升級的核心優勢】
多片透鏡高效聚光系統：提供高強度且分布均勻的激發光斑，高品質帶通濾光片確保獨立通道熒光純凈明亮。

豐富通道選配：標配 UV（DAPI）、B（FITC/GFP）、G（TRITC/CY3）三色組，并可選配 Y（mCherry）、R（CY5）等，精準匹配 Calcein AM 與 PI 染料。

三、 Calcein AM / PI 雙色熒光檢測標準解決方案流程

為確保升級后的 CKX53 顯微鏡在進行 Calcein AM / PI 雙色檢測時獲得高信噪比與高重復性的數據，建議遵循以下標準化實施流程：

步驟 1：試劑配制與細胞樣品洗滌

• 工作液配制：使用無熒光背景的無血清培養基或 PBS 緩沖液將 Calcein AM 與 PI 儲存液稀釋成雙染色工作液（建議終濃度：Calcein AM 約 2 μM，PI 約 4 μM），現配現用并避光保存。

• 樣品洗滌：取待測貼壁或懸浮細胞（如 96 孔板或 35mm 培養皿中的細胞），用溫育的 PBS 輕輕洗滌 1–2 次，消除培養基中血清酯酶成分對 Calcein AM 的干擾。

步驟 2：樣品孵育與染色

• 加入染色液：向細胞樣品中加入適量配制好的 Calcein AM / PI 雙染色工作液，確保覆蓋細胞層。

• 避光溫育：置于 37°C、5% CO? 細胞培養箱中避光溫育 15–30 分鐘。孵育完成后可直接觀察（若背景較高，可用 PBS 輕輕洗滌一次）。

步驟 3：CKX53 上樣與明場/相襯快速定位

• 放置樣品：將培養板或培養皿置于 CKX53 載物臺上，調節 Universal Holder 通用標本夾固定。

• 相襯尋焦：開啟 LED 明場光源，利用 iPC 整合相襯系統（4X–40X 切換無需換相襯環）快速尋找代表性視野并完成對焦與細胞形態初檢。

步驟 4：電動智能熒光通道切換與采集

• B 通道采集（活細胞）：通過 CKX-UVBG-E 單指按鍵一鍵切換至 B 激發通道（FITC），LED 光源開啟，快速對焦并采集活細胞黃綠熒光圖像（胞質發光）。

• G 通道采集（死細胞）：按下按鍵快速切換至 G 激發通道（TRITC），智能還原預設紅光功率，采集死細胞紅色熒光圖像（胞核發光）。

步驟 5：圖像合成與細胞存活率定量評估

• 圖像傳輸與疊加：通過相機接口將圖像傳輸至電腦，利用配套分析軟件對 FITC 綠光通道與 TRITC 紅光通道進行 Overlay/Merge 通道疊加。

• 存活率計算：分別統計視野內的綠光活細胞數（Live）與紅光死細胞數（Dead），計算細胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

四、典型圖像結果與數據評估

在 CKX53 優良光學系統與升級后 CKX-UVBG-E 模塊的支撐下，Calcein AM / PI 雙色染色呈現出清晰的形態學與熒光光譜特征：

觀察模式/通道	標本熒光形態特征	CKX53 升級后成像優勢
B 激發通道 (FITC) (Ex 470/35nm)	活細胞胞質呈強黃綠熒光，質膜完整，細胞輪廓清晰	大功率 LED 高效聚光，全視野激發均勻；獨立帶通濾光片透光率高，活細胞形態細節與偽足清晰可見。
G 激發通道 (TRITC) (Ex 545/25nm)	死細胞 / 膜受損細胞質膜破損，胞核呈顯著紅色熒光，胞質發光極弱	光強記憶功能確保切換無延遲，高截止濾光片有效抑制背景自發熒光，死細胞紅核對比度顯著，識別準確。
雙通道 Fusion 疊加 / 相襯 Overlay	綜合存活率評估同步計算活性率與受損率	電動切換順暢，多通道疊加無焦平面與位置偏離；相襯與熒光圖譜無縫疊加，為準確定量提供依據。

五、規范操作注意事項與設備保養建議

5.1 染色時間控制：孵育時間過長可能導致 Calcein 滲出胞外增加背景熒光，或 PI 少量被活細胞內吞造成誤判，建議控制在 15–30 分鐘內完成觀察。

5.2 LED 激發強度適度調控：充分利用 CKX-UVBG-E 模塊的無級調光與光強記憶功能，在拍攝對比度滿足的前提下適當調低激發功率，減緩熒光探針淬滅。

5.3 風扇風道防堵與清潔：保證熒光模塊側面主動散熱風扇的風道通暢，避免遮擋，定期用干燥氣吹清理風扇網罩灰塵。

5.4 鏡片與部件擦拭維護：若載物臺或物鏡沾染培養基或染色液，應及時用 75% 乙醇濕潤無塵紙輕輕擦拭，保持優良的透光性能與設備衛生。